Грунтовка с антисептиком глубокого проникновения от плесени и грибка на стенах

Эти современные средства предотвращают появление грибков с плесенью. Такие виды обработки актуальны при строительстве на последних стадиях. До того, как начнётся декоративная отделка. В этом случае грунтовка от плесени и грибка на стенах имеет смысл.

Грунтовка против грибка и плесени – что это такое и как работает

Антигрибковые грунтовки глубокого проникновения по бетону – название специальных средств, разработанных для защиты от дефектов на поверхностях. Развитие вредных микроорганизмов не стало исключением. Напольные и стеновые поверхности, потолочные перекрытия проходят обработку внутри помещении, где влажность всегда завышена.

Напольные и стеновые поверхности, потолочные перекрытия проходят обработку внутри помещении, где влажность всегда завышена.

Преимущества и недостатки

В составе таких материалов – фунгицидный препарат. Так называют специальные разновидности веществ, уничтожающие вредные микроорганизмы.

У грунтования есть и другие задачи, которые оно выполняет:

• Защита от гниения в структуре материала;
• Отталкивание влаги за счёт специального покрытия;
• После окрашивания неприятные запахи нейтрализуются;
• Отделка с повышенной прочностью;
• Вероятность повторных трещин после окрашивания уменьшена;
• Финишная отделка качественнее;
• Потом отделочных материалов расходуется не так много. Это касается любых разновидностей, применяемых в строительстве.

Недостатки у такого метода обработки практически отсутствуют. В некоторых случаях это наличие вредных для здоровья выделений и веществ. Но от них легко защититься, когда применяется грунтовка противогрибковая.

После окрашивания неприятные запахи нейтрализуются.

Состав и технические характеристики

Способность уничтожать болезнетворные микроорганизмы является главным свойством для таких отделочных материалов. С помощью фунгицидов состав проникает не только на поверхность, но и вглубь. После обработки поверхности надёжно защищены от проблем в дальнейшем.

Из других важных свойств стоит отметить полную защиту от любых негативных воздействий. Покупателю остаётся только выбрать, какие характеристики важнее. И какая ему нужна грунтовка с антисептиком против плесени.

Способность уничтожать болезнетворные микроорганизмы является главным свойством для таких отделочных материалов.

Виды антибактериальных грунтовок по назначению

Состав грунтовки против плесени и грибка определяется материалом для нанесения. Разновидность отделочных верхних покрытий тоже имеет значение. Средство помогает с профилактикой вне зависимости от типа строительства или ремонта. Каждая разновидность отличается своим набором характеристик.

Средство помогает с профилактикой вне зависимости от типа строительства или ремонта.

На основе акрила

Улучшение сцепления между материалами происходит за счёт акриловых смол в составе. Главные преимущества – быстрое высыхание и отсутствие в составе вредных веществ. При сохранении влажности на высоком уровне это решение помогает обрабатывать фасады, помещения.

Главные преимущества – быстрое высыхание и отсутствие в составе вредных веществ.

На основе кварца

Антигрибковая грунтовка, созданная на основе песка. Нанесение способствует созданию шероховатости, улучшающей адгезию материалов. Нанесение слоя идёт перед окраской или другими декоративными материалами.

Нанесение способствует созданию шероховатости, улучшающей адгезию материалов.

Минеральная

Основа — цементно-гипсовая. Применяется на бетонных и кирпичных основаниях, предварительно оштукатуренных или покрытых силикатными материалами. Для здоровья человека эти разновидности составов абсолютно безопасны. Высыхание занимает всего около 2 часов. Хороший вариант.

Применяется на бетонных и кирпичных основаниях, предварительно оштукатуренных или покрытых силикатными материалами.

Алкидная

Для основ из дерева. Эксплуатационный срок увеличивается, обеспечивается защита. Выпускаются разные типы алкидных составов в зависимости от вида поверхности:

• Кафель;
• Стекло;
• Сталь.

Покрытие не сочетается с гипсокартоном и перекрытиями, которые были оштукатурены. Полное высыхание занимает от 12 часов.

Некоторые средства нацелены только на профилактику, не предполагают полного уничтожения грибка. Об этом стоит помнить перед покупкой. Потому важно изучать инструкцию. Материал, на который идёт нанесение, тоже надо учитывать. Потолок ведь бывает разным.

Эксплуатационный срок увеличивается, обеспечивается защита.

Обработка антигрибковой грунтовкой, инструкция применения

Материалы наносят непосредственно на участки, которые подвергаются заражению. Но не нужно наносить вещество именно на пятна. Поверхность рекомендуется заранее промыть, чтобы очистить её. Для этого используют хлор, а потом уже прибегают к дальнейшей обработке.

Материалы наносят непосредственно на участки, которые подвергаются заражению.

Подготовка поверхности и дополнительные советы

Действие грунтовок увеличивается по времени, если позаботиться о предварительной обработке стен. После выветривания и высыхания допускается применение паяльников или фенов, чтобы обработка дала результат.

Другие рекомендации от специалистов выглядят следующим образом:

• Очистка и предварительная сушка стен обязательна, как уже упоминалось;
• Плесень просто очистить «белизной», разбавленной с водой. Но не стоит окончательно успокаиваться, даже если пятен больше не видно. Очищение строительным феном, паяльной лампой проходит быстрее. Но под обои такой способ лучше не применять;
• Обязательно проветривание помещений. Конвекторы или вентиляторы справляются с этой работой внутри ванных комнат. При других обстоятельствах открывают настежь окна, создавая сквозняки;
• Нельзя применять обычную грунтовку до того, как использована противогрибковая. Ведь другие материалы образуют защитные плёнки, которые препятствуют проникновению внутрь не только вредных микроорганизмов, но и полезных веществ;
• Сохранение сухости в помещениях, тёплое время – оптимальные условия для работы;
• Аэрозоли, кисти и валики качественнее всего помогают мастеру. Тем более при наличии щетины с натуральными волокнами. Благодаря такому методу состав наносят даже в труднодоступных местах.
• Соблюдение мер безопасности обязательно во время работы. Даже если обрабатывается дерево.

Сохранение сухости в помещениях, тёплое время – оптимальные условия для работы.

Порядок работ

Распределяя состав по поверхности, берут валики или кисти, распылители. Валик сочетается с небольшими площадями. Кисть усложняет ремонтные работы, но позволяет без проблем добраться до труднодоступных мест. Распылитель берут, если площадь обработки действительно большая.

Несколько этапов входит в антигрибковую обработку:

1. Нанесение слоя с противогрибковой грунтовкой для стен.
2. Ждут некоторое время, пока всё высохнет.
3. Если необходимо – наносят второй слой.
4. Финишная отделка после полного высыхания.

Сохранение положительной температуры окружающей средой – основное условие для успешного проведения работы. Негативные факторы сохраняются одинаково при отделке внутри и снаружи. При использовании антигрибковых средств защита от вредных микроорганизмов упрощается. Выбор, какой вид грунта антигрибкового использовать в конкретном случае, определяется видом и состоянием поверхности.

Кисть усложняет ремонтные работы, но позволяет без проблем добраться до труднодоступных мест.

Расход грунтовки на 1 м2

Качество, характеристики и виды материалов для обработки влияют на то, каким будет расход материалов. Не последнюю роль играют температура с влажностью, которые сохранились в помещении. Показатель увеличивается, если грунтовки от плесени требуется хотя бы два слоя, а не один.

Расходные нормы указываются производителем на упаковке. Но мастера рекомендуют умножать стандартные коэффициенты на 1,5 минимум. Тогда проще будет предвидеть некоторые ситуации.

Для работы с бетонными поверхностями подходит большая часть универсальных составов. Производители дают рекомендации относительно мест использования и эксплуатационных условий. С ними надо ознакомиться до покупки, только в этом случае анти грибковый состав будет эффективным.

Для работы с бетонными поверхностями подходит большая часть универсальных составов.

При использовании любой грунтовки обязательно соблюдать технику безопасности и защищать себя. Инструкции и советы по работе тоже прочитываются до того, как проект начинают воплощать в жизнь. Респиратор и защитные очки необходимы каждому. Саму грунтовку хранят в тех местах, где до неё не смогут добраться дети. Не стоит сразу следовать советам о покупке составов с запасом. Докупить материалы не составит труда. А вот использовать излишки трудно – велика вероятность, что срок годности выйдет раньше. Это предостерегает и от ненужных трат.

Видео: Грунтовка от А до Я

Универсальная грунтовка с антисептиком – новый продукт в линейке «Ореол Дисконт»

28 мая 2015

Универсальная грунтовка с антисептиком – новый продукт в линейке «Ореол Дисконт»

С 1-го июня 2015 г. ЗАО «Эмпилс» начинает поставки клиентам новинки — полиакриловой универсальной грунтовки с антисептиком «Ореол Дисконт». Новый продукт дополнил ассортиментную линейку этой торговой марки, которая включает также грунтовку глубокого проникновения, грунтовку глубокого проникновения с антисептиком и укрепляющий грунт-концентрат.

1 из 2 >>

Для универсальной грунтовки с антисептиком «Ореол Дисконт» характерна привлекательная цена, при этом продукт сохраняет главные потребительские свойства – он обладает необходимым набором свойств для обеспыливания поверхности перед ее отделкой и снижает расход последующих покрытий.

Универсальная грунтовка «Ореол Дисконт» применяется для пропитки и улучшения сцепляющей способности различных поверхностей с декоративными покрытиями. Она укрепляет обрабатываемую поверхность, выравнивает впитывание и уменьшает поглощающую способность подложки. Грунтовку используют перед нанесением шпатлевок, водно-дисперсионных красок, а также перед оклейкой обоями. Благодаря входящему в ее состав антисептику универсальная грунтовка «Ореол Дисконт» подавляет рост грибков, дрожжевых бактерий, предотвращает появление плесени.

Универсальная грунтовка «Ореол Дисконт» применяется как для наружных, так и для внутренних работ. Она удобна в работе — легко наносится, быстро сохнет и не имеет резкого запаха, так как является покрытием на водной основе.

Универсальная грунтовка с антисептиком «Ореол Дисконт» поступает в продажу в фасовке по 1кг, 5 кг и 10 кг.

Торговая марка «Дисконт» была разработана в рамках расширения бренда «Ореол». Продукты «Ореол Дисконт» позиционируются в сегменте «эконом» и предоставляют покупателям возможность приобрести современные и экологически безопасные водно-дисперсионные лакокрасочные материалы известной марки по доступной цене.

ВГТ ВД-АК-0301 грунтовка глубокого проникновения с антисептиком

Влияние антибактериальных праймеров с четвертичным аммонием и нано-серебром на Streptococcus mutans, импрегнированные в блоки дентина человека

Задача: В недавних исследованиях были разработаны антибактериальные связующие агенты и композиты, содержащие диметакрилат четвертичного аммония (QADM) и наночастицы серебра (NAg). Цели этого исследования заключались в изучении: (1) эффекта антибактериальных праймеров, содержащих QADM и NAg, на ингибирование Streptococcus mutans, импрегнированных в блоки дентина, и (2) влияние QADM или NAg по отдельности или в комбинации. , а влияние массовой доли NAg на S.mutans в дентине.

Методы: Использовали связующий агент Scotchbond Multi-Purpose (SBMP). QADM и NAg были включены в праймер SBMP. Было протестировано шесть праймеров: контроль праймера SBMP, контроль + 10% QADM (мас.%), Контроль + 0,05% NAg, контроль + 10% QADM + 0,05% NAg, контроль + 0,1% NAg и контроль + 10% QADM + 0,1%. NAg. Блоки дентина пропитывали S. mutans, затем наносили праймер.Затем измеряли жизнеспособные колониеобразующие единицы (КОЕ), собирая бактерии в дентине с помощью метода обработки ультразвуком.

Полученные результаты: Контроль + 10% QADM + 0,1% NAg имел зону ингибирования бактерий в 8 раз больше, чем контроль (p <0,05). Метод ультразвуковой обработки успешно убрал бактерии с блоков дентина. Контроль + 10% QADM + 0,1% NAg подавлял S. mutans в блоках дентина, снижая количество жизнеспособных КОЕ в дентине на три порядка по сравнению с контрольным дентином без праймера.Использование QADM + NAg было более эффективным, чем использование только QADM. Более высокое содержание NAg увеличивало эффективность. Прочность связи дентина при сдвиге была одинаковой для всех групп (p> 0,1).

Значение: Было показано, что антибактериальный праймер с QADM и NAg впервые ингибирует S. mutans, импрегнированные в дентинные блоки. Бондинг, содержащий QADM и NAg, обещает уничтожить бактерии в полости зуба и подавить кариес.QADM и NAg могут применяться к другим клеям, цементам, герметикам и композитам.

(PDF) Влияние антибактериальных праймеров с четвертичным аммонием и нано-серебром на Streptococcus mutans, импрегнированные в блоки дентина человека

Цель: В недавних исследованиях были разработаны антибактериальные связующие агенты и композиты, содержащие диметакрилат четвертичного аммония (QADM) и наночастицы серебра (NAg). Цели этого исследования заключались в изучении: (1) эффекта антибактериальных праймеров, содержащих QADM и NAg, на ингибирование Streptococcus mutans, импрегнированных в блоки дентина, и (2) влияние QADM или NAg по отдельности или в комбинации. , а влияние массовой доли NAg на S.mutans в дентине. Методы: Использовали связующий агент Scotchbond Multi-Purpose (SBMP). QADM и NAg были включены в праймер SBMP. Было протестировано шесть праймеров: контроль праймера SBMP, контроль + 10% QADM (мас.%), Контроль + 0,05% NAg, контроль + 10% QADM + 0,05% NAg, контроль + 0,1% NAg и контроль + 10% QADM + 0,1%. NAg. Блоки дентина пропитывали S. mutans, затем наносили праймер. Затем измеряли жизнеспособные колониеобразующие единицы (КОЕ), собирая бактерии в дентине с помощью метода обработки ультразвуком.Полученные результаты: Контроль + 10% QADM + 0,1% NAg имел зону ингибирования бактерий в 8 раз больше, чем контроль (p <0,05). Метод ультразвуковой обработки успешно убрал бактерии с блоков дентина. Контроль + 10% QADM + 0,1% NAg подавлял S. mutans в блоках дентина, снижая количество жизнеспособных КОЕ в дентине на три порядка по сравнению с контрольным дентином без праймера. Использование QADM + NAg было более эффективным, чем использование только QADM. Более высокое содержание NAg увеличивало эффективность. Прочность связи дентина при сдвиге была одинаковой для всех групп (p> 0.1). Значение: Было показано, что антибактериальный праймер с QADM и NAg впервые ингибирует S. mutans, импрегнированные в дентинные блоки. Бондинг, содержащий QADM и NAg, обещает уничтожить бактерии в полости зуба и подавить кариес. QADM и NAg могут применяться к другим клеям, цементам, герметикам и композитам.

Все рисунки в этой области были загружены Lei Cheng

Контент может быть защищен авторскими правами.

Антисептическая чувствительность и распределение генов антисептической устойчивости у метициллин-устойчивого золотистого стафилококка | Письма о микробиологии FEMS

636″ data-legacy-id=»ss1″> 1 Введение

Метициллин-устойчивый Staphylococcus aureus (MRSA) является клинически значимым патогеном, поскольку MRSA устойчив к целому ряду антибиотиков и вызывает внутрибольничные инфекции во всем мире. Кроме того, из клинических образцов выделен устойчивый к антисептикам и дезинфицирующим средствам MRSA [1, 2].Сообщалось, что два гена, qacA [3] и qacB [4], придают высокий уровень устойчивости к антисептикам, и четыре гена, а именно qacC, qacD [5], ebr [6 ] и smr [7], придают сопротивление низкого уровня. Эти гены устойчивости к антисептикам придают перекрестную устойчивость к широкому спектру структурно разнородных лекарств, а устойчивость обусловлена ​​энергозависимыми механизмами оттока лекарств [5, 7, 8]. Анализ нуклеотидных последовательностей показывает, что qacA очень похож на qacB [4], а smr совпадает с qacC, qacD и ebr [7].Следовательно, гены устойчивости к антисептикам можно структурно разделить на два семейства: qacA и smr .

Поскольку вспышки внутрибольничных инфекций, вызванных MRSA, впервые стали серьезной проблемой, контрмеры были сосредоточены на профилактике инфекции, а не на лечении. Для предотвращения инфекций, вызываемых MRSA, используются различные антисептики и дезинфицирующие средства, а история устойчивости к антибиотикам позволяет нам с уверенностью прогнозировать появление и распространение устойчивых к антисептикам бактерий. qacA и smr обнаруживаются не только у S. aureus , но и у коагулазонегативных стафилококков [9]. Однако почти все исследованные штаммы S. aureus были выделены до 1989 г.

Чтобы идентифицировать гены устойчивости к антисептикам у MRSA и определить, появились ли в последнее время в Японии новые устойчивые штаммы, мы изучили чувствительность к антисептикам и распространение типичных антисептиков. -гены устойчивости, qacA и smr , в MRSA.

641″ data-legacy-id=»ss2-1″> 2.1 Штаммы бактерий

В данном исследовании было отобрано 98 штаммов MRSA, выделенных из разных больниц, расположенных в разных регионах. Эти штаммы были собраны в 1992 году со всей Японии Токийским центром клинических исследований. Чувствительные к антисептикам S. aureus RN27, RN450, RN2677 [10], JCM2143, JCM2847, FDA209P, MS353 [11] использовали в качестве эталонных штаммов для определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК).RN2677 и RN2677, несущие плазмиду pTZ20, кодирующую smr [6], использовали в качестве отрицательного и положительного контролей для полимеразной цепной реакции (ПЦР) соответственно.

645″ data-legacy-id=»ss2-3″> 2.3 Получение ДНК

получали для ПЦР из S. aureus следующим образом. Одну колонию из чашки с трипто-соевым агаром суспендировали в 100 мкл лизирующего буфера (10 мМ Трис-HCl pH 8,0, 10 мМ NaCl, 0,1 М ЭДТА, 2 мкг мл ^-1 лизостафина (Вако, Осака, Япония)) и инкубировали при 37 ° C в течение 30 мин. После центрифугирования осадок клеток ресуспендировали в 1 мл воды и нагревали при 95 ° C в течение 10 мин. Суспензию центрифугировали при 10 000 об / мин в течение 5 мин и супернатант использовали в качестве образца ДНК для ПЦР.Плазмидную ДНК выделяли с помощью системы очистки ДНК Wizard plus minipreps (Promega, Madison, WI). В случае S. aureus клетку суспендировали в буфере для суспензии клеток, содержащем 50 мкг ^-1 лизостафина и 1 мг ^-1 лизоцима, и инкубировали в течение 30 минут при 37 ° C.

SMR Прямой праймер 5′-CTATGGCAATAGGAGATATGGTGT 417 [6] Обратный праймер 5′-CCACTACAGATTCTTCAGCTACATG 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 Справочник qacA Прямой праймер 5′- ATGCCTTATATTTATTTAATAATAGCC 321 [3] Обратный праймер 5′- ATGCGATGTTCCGAAAATGTTTAAC smr Прямой праймер 5′-CTATGGCAATAGGAGATATGGTGT 417 [6] 9015AC15 CCAC15 9022 CC3 9022 CC3 9022 CC3 9022

Последовательности праймеров, используемых для амплификации qacA и smr

Прямой праймер 5′- Обратный праймер 5′- SMR 9015 9015 SMR Прямой праймер 5′- Обратный праймер 5′-

Праймер	Последовательность	Размер продукта (п.о.)	Ссылка
		015
	ATGCCTTATATTTATTTAATAATAGCC	321	[3]
	ATGCGATGTTCCGAAAATGTTTAAC
Прямой праймер	5′-CTATGGCAATAGGAGATATGGTGT	417	[6]
Обратный праймер	5′-CCACTACAGATTCTTCAGCTACATG		9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015
Ссылка
qacA
Прямой праймер	5′-ATGCCTTATATATTATTTAATAATAATAGCC3	9015 9015 9015 32153						9015 TCCGAAAATGTTTAAC
	CTATGGCAATAGGAGATATGGTGT	417	[6]
	CCACTACAGATTCTTCAGCTACATG

652″ data-legacy-id=»ss3″> 3 Результаты

МИК EB (мкг мл ^{— 1} ) ≥1.56 3,13 6,25 12,5 25 50 100 200> 200 Всего ≥3,13 1 2 6,25 2 45 19 1 20 25 18 (1 с) 50 1 2 (1 с) 8 (6 с) 100 1 4 (4s) 5 (4s) 200 1 (1 с) 1 (1 с) 5 (3 с) 400 9015 3 3 5 3 (3с) 2 (2сек) 13 (5сек)> 400 6 1 (1a) 9 (9a) 18 (10a) Итого 1 3 23 13 16 (2s 12s) 3 (3s) 4 (3s + 1a) 9 (9a) 98 (20s + 10a)5 9015 3 9015 12s)

MIC AF (мкг мл −1 ) 9015	МИК EB (мкг мл -1 )
	≥1.56	3,13	6,25	12,5	25	50	100	200	> 200	Всего
≥3,13	1					2
6,25		2	4													19	1						20
25														18 (1 с)
50				1	2 (1 с)	8 (6 с)							100					1	4 (4s)				5 (4s)
200								1 (1 с)		1 (1 с)		5 (3 с)
400				3	5	3 (3 с)	2 (2 с)		13 (5 с)
> 400					6		1 (1a)	9 (9a)	18 (10a)
Итого	1	3	23	13		3 (3s)	4 (3s + 1a)	9 (9a)	98 (20s + 10a)

2

Распределение МИК EB и AF и антисептических генов qacA и smr в 98 изолятах MRSA

5 9015 3 16 (2s 12s)

МИК AF (мкг мл -1 )	МИК EB (мкг мл -1 )
	≥1.56	3,13	6,25	12,5	25	50	100	200	> 200	Всего
≥3,13	1					2
6,25		2	4													19	1						20
25														18 (1 с)
50				1	2 (1 с)	8 (6 с)							100					1	4 (4s)				5 (4s)
200								1 (1 с)		1 (1 с)		5 (3 с)
400				3	5	3 (3с)	2 (2сек)		13 (5сек)
> 400					6		1 (1a)	9 (9a)	18 (10a)
Итого	1	3	23	13		3 (3s)	4 (3s + 1a)	9 (9a)	98 (20s + 10a)

5 9015 3 16 (2s 12s)

MIC AF (мкг мл −1 ) 9015	МИК EB (мкг мл -1 )
	≥1.56	3,13	6,25	12,5	25	50	100	200	> 200	Всего
≥3,13	1					2
6,25		2	4													19	1						20
25														18 (1 с)
50				1	2 (1 с)	8 (6 с)							100					1	4 (4s)				5 (4s)
200								1 (1 с)		1 (1 с)		5 (3 с)
400				3	5	3 (3с)	2 (2сек)		13 (5сек)
> 400					6		1 (1a)	9 (9a)	18 (10a)
Итого	1	3	23	13		3 (3s)	4 (3s + 1a)	9 (9a)	98 (20s + 10a)

3

МПК антисептиков и фторхинолонов против 98 изолятов MRSA

> 200 /> 200) 9015 200153

Группа	No.штамма	Ген	Диапазон MIC (MIC 50 / MIC 90 )
			EB	AF	BT	CH 9015LX	N
A	10	qacA	≥200	> 400	3,13–12,5	3,13–12,5	1,56–> 200	ND				(> 400 /> 400)	(12.5 / 12,5)	(3,13 / 3,13)	(25 /> 200)
														smr	25–400	25–400	3,13–6,25	1,56–3,13	1,56–> 200	0,05–> 25
				)	(100/400)	(6.25 / 6,25)	(3,13 / 3,13)	(3,13 / 200)	(0,1 / 25)
																19	( norA )	25–50	100–> 400	3,13–6,25	1,56–3,13	25–> 200	0,1 50
		(50/50)	(400 /> 400)	(3.13 / 3,13)	(3,13 / 3,13)	(3,13 / 3,13)	(6,25 / 25)
										22		12,5–50	12,5–100	1,56–3,13	1,56–3,13	0,78–> 200	0,05–> 50
	(12.5/25)	(25/50)	(1,56 / 3,13)	(1,56 / 1,56)	(50 /> 200)	(6,25 / 25)
S	27		1,56–6,25	3,13–12,5	0,39–0,78 9015–1			0,39–0,78
			(6.25 / 6,25)	(12,5 / 12,5)	(0,78)	(0,78 / 0,78)	(100 /> 200)
R	7		1,56–6,25	3,13–12,5	0,78–1,56	0,78–1,56	0,7816–1,56	0,7816–1,56		(3.13 / 6,25)	(6,25 / 12,5)	(1,56 / 1,56)	(1,56 / 1,56)	(1,56 / 1,56)	(0,1 / 0,2)

Номер штамма SP 9001 900 ( norA ) (3,13 / 3,13) 50)

Группа	Ген	Диапазон МИК (МИК 50 / МИК 90 )
			EB	AF	BT	CH
A	10	qacA	≥200	> 400	3.13–12,5	3,13–12,5	1,56–> 200	ND
			(> 200 /> 200)	(> 400 /> 400)	(12,5 / 12,5)	(3,13 / 3,13)	(25 /> 200)
											25–400	25–400	3.13–6,25	1,56–3,13	1,56–> 200	0,05–> 25
			(50/200)	(100/400)	(6,25 / 6,25)	(3,13 / 3,13)	(3,13 / 200)	(0,1 / 25)
													25–50	100–> 400	3.13–6,25	1,56–3,13	25–> 200	0,1 50
			(50/50)	(400 /> 400)	(3,13 / 3,13)	(3,13 / 3,13)	(6,25 / 25)
											12.5–50	12,5–100	1,56–3,13	1,56–3,13	0,78–> 200	0,05–> 50
			(12,5 / 253)	(1,56 / 3,13)	(1,56 / 1,56)	(50 /> 200)	(6,25 / 25)
S	27		1.56–6,25	3,13–12,5	0,39–0,78	0,39–1,56	0,39–> 200	ND
			(6,25 / 12,15)	(6,25 / 12,25)	(6,25 / 12,25)	(6,25 / 12,25)	(0,78)	(0,78 / 0,78)	(100 /> 200)
											1.56–6,25	3,13–12,5	0,78–1,56	0,78–1,56	0,78–1,56	0,05–0,2
			(6,215 / 6,23 / 6,2153)	(1,56 / 1,56)	(1,56 / 1,56)	(1,56 / 1,56)	(0,1 / 0,2)

3

МИК антисептиков и фторхинолонов против 98 изолятов группы MRSA

№штамма Ген Диапазон MIC (MIC ₅₀ / MIC ₉₀ ) EB AF BT CH 9015LX N A 10 qacA ≥200> 400 3,13–12,5 3,13–12,5 1,56–> 200 ND > 200 /> 200) (> 400 /> 400) (12.5 / 12,5) (3,13 / 3,13) (25 /> 200) smr 25–400 25–400 3,13–6,25 1,56–3,13 1,56–> 200 0,05–> 25 ) (100/400) (6.25 / 6,25) (3,13 / 3,13) (3,13 / 200) (0,1 / 25) 19 ( norA ) 25–50 100–> 400 3,13–6,25 1,56–3,13 25–> 200 0,1 50 (50/50) (400 /> 400) (3.13 / 3,13) (3,13 / 3,13) (3,13 / 3,13) (6,25 / 25) 9015 22 12,5–50 12,5–100 1,56–3,13 1,56–3,13 0,78–> 200 0,05–> 50 (12.5/25) (25/50) (1,56 / 3,13) (1,56 / 1,56) (50 /> 200) (6,25 / 25) S 27 1,56–6,25 3,13–12,5 0,39–0,78 9015–1 0,39–0,78 200153 (6.25 / 6,25) (12,5 / 12,5) (0,78) (0,78 / 0,78) (100 /> 200) R 7 1,56–6,25 3,13–12,5 0,78–1,56 0,78–1,56 0,7816–1,56 0,7816–1,56 (3.13 / 6,25) (6,25 / 12,5) (1,56 / 1,56) (1,56 / 1,56) (1,56 / 1,56) (0,1 / 0,2) Номер штамма SP 9001 900 ( norA ) (3,13 / 3,13) 50)

Группа	Ген	Диапазон МИК (МИК 50 / МИК 90 )
			EB	AF	BT	CH
A	10	qacA	≥200	> 400	3.13–12,5	3,13–12,5	1,56–> 200	ND
			(> 200 /> 200)	(> 400 /> 400)	(12,5 / 12,5)	(3,13 / 3,13)	(25 /> 200)
											25–400	25–400	3.13–6,25	1,56–3,13	1,56–> 200	0,05–> 25
			(50/200)	(100/400)	(6,25 / 6,25)	(3,13 / 3,13)	(3,13 / 200)	(0,1 / 25)
													25–50	100–> 400	3.13–6,25	1,56–3,13	25–> 200	0,1 50
			(50/50)	(400 /> 400)	(3,13 / 3,13)	(3,13 / 3,13)	(6,25 / 25)
											12.5–50	12,5–100	1,56–3,13	1,56–3,13	0,78–> 200	0,05–> 50
			(12,5 / 253)	(1,56 / 3,13)	(1,56 / 1,56)	(50 /> 200)	(6,25 / 25)
S	27		1.56–6,25	3,13–12,5	0,39–0,78	0,39–1,56	0,39–> 200	ND
			(6,25 / 12,15)	(6,25 / 12,25)	(6,25 / 12,25)	(6,25 / 12,25)	(0,78)	(0,78 / 0,78)	(100 /> 200)
											1.56–6,25	3,13–12,5	0,78–1,56	0,78–1,56	0,78–1,56	0,05–0,2
			(6,215 / 6,23 / 6,2153)	(1,56 / 1,56)	(1,56 / 1,56)	(1,56 / 1,56)	(0,1 / 0,2)

MIC (мкг мл ⁻¹ ) Относительная скорость оттока EB BK CH NFLX OFLX NA Бесплатно 6,25 50 12,5 0,78..1 <0,1 50 1 pTZ244 ( norA23 ) 800> 800 100 6,25 6,25 0,39 6,25 0,39 pTZ261 ( norA )400 400 25 6,25 3,13 0,2 100 2,03 ± 0,43 * МИК (мкг мл ^-1 ) Относительная скорость оттока AF EB BK CH NFLX OFLX NA NA NA 6.25 50 12,5 0,78 <0,1 <0,1 50 1 pTZ244 ( norA23 ) 800 9015 6,2 100 6,2 100 0,39 400 5,35 ± 1,49 * pTZ261 ( norA ) 400 400 25 6,25 3,13 0.2 100 2,03 ± 0,43 * 4

МИК для E. coli JM109, несущих norA23 , и относительная скорость оттока EB

9 мкг 32 мл 77 ( −1 ) бесплатно25

Плазмида (ген)	Относительная скорость оттока
	AF	EB	BK	CH	NFLX	OFLX	NA
				50	12,5	0,78	<0,1	<0,1	50	1
pTZ244 ( norA23 )	800	9015 6,2 100		6,2 100	0,39	400	5,35 ± 1,49 *
pTZ261 ( norA )	400	400	25	6,25	3,13	0.2	100	2,03 ± 0,43 *

..1 9 по крайней мере четыре результата показали антипсихологические результаты гены устойчивости, включая qacA и smr , могут быть идентифицированы в MRSA.Наши результаты также показали, что устойчивые к антисептикам штаммы MRSA без генов qacA и smr уже получили широкое распространение в Японии.

4 Обсуждение

В настоящем исследовании мы изучили чувствительность к антисептикам и распределение генов устойчивости к антисептикам у MRSA, выделенного в Японии в 1992 году. Хотя устойчивый к антисептикам MRSA (72%) уже широко распространен в Японии, частота генов qacA и smr и у этих штаммов составляли всего 10 и 20% соответственно.Результаты экспериментов были подтверждены с помощью ПЦР с очищенной ДНК, поскольку частота обнаружения гена smr с помощью ПЦР была выше, чем при гибридизации по Саузерну. Кроме того, штаммы, несущие smr , показали широкий диапазон МИК (25-200 мкг мл ^-1 ) EB по сравнению с ранее опубликованными данными МИК (20-50 мкг мл ^-1 ) для smr [1 , 9, 12]. Когда мы провели гибридизацию smr и трансформацию плазмидой с использованием нескольких штаммов, которые несли smr и демонстрировали высокий уровень устойчивости к AF (MIC: 400 мкг / мл ^-1 ), все трансформанты показали примерно одинаковые значения MIC. EB в качестве исходных штаммов и содержал 2.Плазмида размером 4 т.п.н., гибридизованная с геном smr . Однако МПК AF для нескольких трансформантов (50–400 мкг / мл ^–1 ) отличались от таковых для исходных штаммов. Эти результаты предполагают появление smr , который выражает высокий уровень устойчивости к EB, и наличие второй детерминанты устойчивости к антисептикам. Механизм повышенной устойчивости к EB, опосредованной smr , и идентификация второй детерминанты устойчивости в настоящее время исследуются в наших лабораториях.

В устойчивом к антисептике MRSA ( n = 71), идентифицированном в настоящем исследовании, 41 штамм (58%) не нес ни qacA , ни smr . Основным открытием настоящего исследования было клонирование хромосомного гена norA23 из штамма MRSA, который проявлял высокий уровень устойчивости к AF. Предыдущие исследования показали, что повышенная устойчивость к фторхинолонам, опосредованная norA , обусловлена ​​мутациями, вызывающими сверхэкспрессию norA [15, 16].Однако мутации, которые вызывают устойчивость к антисептикам и NFLX на или A23 , не могут быть идентифицированы в настоящем исследовании. Это было связано с отсутствием мутации norA23 в сайте мутации norA и norA1199 [15, 16], и что norA23 показал много различий не только в последовательностях ДНК norA и norA1199. , но и выведенные аминокислотные последовательности (рис. 1). Почему norA23 повысил устойчивость к антисептикам, станет предметом будущего исследования.Кроме того, хотя три гена устойчивости к фторхинолонам, norA, grlA и gyrA , были идентифицированы у S. aureus [17], мутация norA придает устойчивость к NFLX, но не к спарфлоксацину (SPFX) [ 14, 15]. Семь (37%) из 19 штаммов, которые считались мутантами или , были чувствительны к SPFX. Результаты подтверждают мнение о том, что устойчивость семи штаммов к AF и NFLX обусловлена ​​мутацией norA и что другие 12 штаммов, которые демонстрируют высокий уровень устойчивости к NFLX, по-видимому, страдают не только или A , но и grlA и / или gyrA образуют мутации.Кроме того, ParC, кодируемый grlA , по-видимому, является основной мишенью фторхинолонов в S. aureus , а мутант grlA был впервые получен путем одноэтапной селекции фторхинолонов [17]. Следовательно, кажется вероятным, что мутация norA может появиться под давлением отбора антисептиков и дезинфицирующих средств, а не под давлением отбора фторхинолонов.

С другой стороны, у оставшихся штаммов с низким уровнем устойчивости без qacA и smr , хотя мы попытались передать устойчивость к антисептикам в S.aureus конъюгацией и / или трансформацией плазмидами не было получено ни трансформанта, ни трансконъюганта. Эти результаты предполагают, что ген, связанный с устойчивостью к антисептикам, расположен на хромосоме S. aureus , и мутация его гена может повысить устойчивость к антисептикам, как это было в случае с norA [15, 16].

Хотя большинство генов устойчивости к антисептикам в S. aureus , которые были протестированы до 1990 г., были обнаружены на плазмидах [1, 2], наше исследование показывает, что устойчивые к антисептикам штаммы, обусловленные другими генами, предположительно на хромосоме S .aureus , например norA , широко распространены в Японии.

Благодарности

Мы благодарны доктору Р. Новику за предоставление штаммов RN S. aureus . Мы также благодарим Н. Табара, С. Секизука, М. Сэйта и М. Ошита за их техническую помощь. Эта работа была частично поддержана грантом Министерства здравоохранения и социального обеспечения и еще одним грантом Корпорации поощрения и взаимопомощи для частных школ Японии.

Список литературы

[1]

(

1986

)

Выделение и характеристика семейства малых плазмид, кодирующих устойчивость к соединениям, связывающим нуклеиновые кислоты, у Staphylococcus aureus

.

J. Med. Microbiol.

22

,

9

—

15

. [2]

(

1986

)

Закодированная плазмидой устойчивость к акрифлавину и четвертичным аммониевым соединениям у метициллин-резистентных Staphylococcus aureus

.

FEMS Microbiol. Lett.

34

,

47

—

51

. [3]

(

1990

)

Антисептический ген, опосредованный оттоком qacA из Staphylococcus aureus : общий предок с тетрациклиновыми белками и белками, транспортирующими сахар

.

Мол. Microbiol.

4

,

2051

—

2062

. [4]

(

1996

)

Белки множественной лекарственной устойчивости QacA и QacB из Staphylococcus aureus : топология мембраны и идентификация остатков, участвующих в субстратной специфичности

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

93

,

3630

—

3635

. [5]

(

1991

)

Структура и эволюция семейства генов, кодирующих устойчивость к антисептическим и дезинфицирующим средствам у Staphylococcus aureus

.

Gene

101

,

59

—

66

. [6]

(

1989

)

Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего устойчивость к бромистому этидию из переносимой плазмиды в Staphylococcus aureus

.

Nucleic Acids Res.

17

,

10103

. [7]

(

1992

)

Продукт гена множественной лекарственной устойчивости стафилококков является членом нового семейства белков

.

Плазмида

27

,

119

—

129

. [8]

(

1996

)

Протон-зависимые системы множественного лекарственного оттока

.

Microbiol. Ред.

60

,

575

—

608

. [9]

(

1994

)

Множественная лекарственная устойчивость к антисептикам и дезинфицирующим средствам у коагулазонегативных стафилококков

.

J. Med. Microbiol.

40

,

214

—

220

. [10]

(

1983

)

Самотрансмиссивные плазмиды стафилококков, которые кодируют устойчивость к аминогликозидам

.

Антимикробный. Агенты Chemother.

24

,

70

—

77

. [11]

(

1976

)

Ассоциация гена устойчивости к пенициллину с плазмидой устойчивости к тетрациклину (pTP-2) в Staphylococcus aureus

.

Антимикробный. Агенты Chemother.

9

,

706

—

712

. [12]

(

1992

)

Высокая устойчивость к бромистому этидию и антисептикам у Staphylococcus aureus

.

FEMS Microbiol. Lett.

93

,

109

—

114

. [13]

(

1985

)

Аутогенная регуляция синтеза белка репликации в плазмиде pSC101

.

Мол. Genet Genet.

200

,

362

—

367

. [14]

(

1990

)

Нуклеотидная последовательность и характеристика гена Staphylococcus aureus norA , который придает устойчивость к хинолонам

.

J. Bacteriol.

172

,

6942

—

6949

. [15]

(

1994

)

Устойчивость к хинолонам, опосредованная norA : физиологическая характеристика и связь с flqB , локусом устойчивости к хинолонам на хромосоме Staphylococcus aureus

.

Антимикробный. Агенты Chemother.

38

,

1345

—

1355

. [16]

(

1993

)

Опосредованная оттоком резистентность к фторхинолонам у Staphylococcus aureus

.

Антимикробный. Агенты Chemother.

37

,

1086

—

1094

. [17]

(

1995

)

Анализ мутаций gyrA и grlA у ступенчато отобранных устойчивых к ципрофлоксацину мутантов Staphylococcus aureus

.

Антимикробный. Агенты Chemother.

39

,

1554

—

1558

.

© 1999 Федерация европейских микробиологических обществ. Опубликовано Elsevier Science B.V. Все права защищены.

Плазмида (ген)	МИК (мкг мл -1 )							Относительная скорость оттока					AF BK	CH	NFLX	OFLX	NA
Бесплатно	6,25	50	12,5	0,78	<0,1	50	1
pTZ244 ( norA23 )	800	> 800	100	6,25	6,25	0,39	6,25	0,39
pTZ261 ( norA )	400	400	25	6,25	3,13	0,2	100	2,03 ± 0,43 *

Частота генов антисептической устойчивости у клинических изолятов стафикокков и энтерококков в Турции | Устойчивость к противомикробным препаратам и инфекционный контроль

qacA / B F	qacA / B	GCA GAA AGT GCA GAG TTC G	361 п.н.	Noguchi et al.[22]
qacA / B R	qacA / B	CCA GTC CAA TCA TGC CTG
смр Ф	смр	GCC ATA AGT ACT GAA GTT ATT GGA	195 п.н.	Noguchi et al.[22]
смр рэнд	смр	GAC TAC GGT TGT TAA GAC TAA ACC T
qacG F	qacG	CAA CAG AAA TAA TCG GAA CT	275 п.н.	Bjorland et al.[15]
qacG R	qacG	ТАС АТТ ТАА ГАГ САС ТАС А
qacH F	qacH	ATA GTC AGT GAA GTA ATA G	295 п.н.	Bjorland et al.[15]
qacH R	qacH	AGT GTG ATG ATC CGA ATG T
qacJ F	qacJ	CTT ATA TTT AGT AAT AGC G	301 п.н.	Bjorland et al.[15]
qacJ R	qacJ	GAT CCA AAA ACG TTA AGA

Частота генов антисептической устойчивости у клинических изолятов стафикокков и энтерококков в Турции | Устойчивость к противомикробным препаратам и инфекционный контроль

Штаммы MRSA, MRCNS и VRE представляют собой условно-патогенные микроорганизмы, передающиеся через руки медицинских работников.BAC и CHDG — это средства для мытья рук и кожные антисептики, которые широко используются для контроля и предотвращения госпитальных инфекций. Многие исследования показали наличие плазмид-опосредованных генов антисептической устойчивости, таких как qacA / B , smr , qacG , qacH и qacJ , а также снижение чувствительности к антисептическим агентам. Другие исследователи сообщили, что плазмиды несут гены устойчивости к антисептикам вместе с генами устойчивости к антибиотикам и способствуют развитию устойчивости у патогенов [23,24,25].В этом исследовании мы попытались найти возможную связь между наличием генов устойчивости к антисептикам и сниженной восприимчивостью к антисептикам или устойчивостью к различным антибиотикам в клинических изолятах Staphylococcus spp . и Enterococcus spp . Мы наблюдали, что 15 (51,7%) из 29 S.aureus и 34 (85,0%) из 40 изолятов ЦНС, всего 49 (71%) из 69 изолятов стафилококков содержали как минимум один ген антисептической устойчивости. Мы также определили, что среди 49 Staphylococcus spp. .Для изолятов, положительных по гену, наиболее доминирующими были гены qacA / B (57,1%), за которыми следовали гены qacJ (36,7%), qacG (32,6%) и smr (22,4%). Ген qacH не был обнаружен ни в одном тестируемом изоляте. Наш Enterococcus spp . изоляты не содержали генов антисептической устойчивости.

К настоящему времени опубликованы два исследования [26, 27] по генам антисептической устойчивости стафилококков в Турции в дополнение к нашему предыдущему исследованию, проведенному в 2012 году [25].Duran et al. [26] сообщили, что частота генов qacA / B и smr среди устойчивых к амикацину S.aureus составляла 47,4% и 28,9% в Турции, соответственно, и этот результат был статистически значимым ( p <0,05 ). В том же исследовании частота qacA / B и smr в ЦНС составила 37,9% и 20,7% соответственно ( p <0,05). В другом исследовании, проведенном в Турции, Aykan et al. [27] сообщили, что 11,6% изолятов MRSA содержат ген устойчивости qacA / B .В этом исследовании мы обнаружили, что 10% наших штаммов MRSA содержали ген qacA / B , и наши результаты были совместимы с результатами Aykan et al. [27]. В нашем предыдущем исследовании (25) мы обнаружили, что гена smr были более распространены (36,0%) в MRSA, тогда как гена qacA / B более распространены (4,0%) в штаммах MSSA. Кроме того, наличие фенотипа устойчивости к iMLSB у 8/18 (44,5%) smr -положительных штаммов по сравнению с 2/32 (6,25%) отрицательных штаммов smr- было статистически значимым ( p <0.001) [25]. Однако, в отличие от нашей предыдущей работы, гены smr и qacA / B присутствовали в штаммах MRSA с одинаковой частотой (10,0%) в этом исследовании. Кроме того, гены smr были более распространены (15,7%), чем гены qacA / B (10,5%) в штаммах MSSA. Более того, мы не смогли найти какой-либо существенной связи между наличием генов устойчивости к антисептикам и устойчивостью к антибиотикам.

Mayer et al. [7] сообщили о результатах европейской исследовательской группы SENTRY по распределению qacA / B и smr в 297 штаммах MRSA и 200 штаммах MSSA, выделенных между 1997 и 1999 годами в 24 различных европейских университетских больницах в 14 странах.Они обнаружили, что 42,0% из S.aureus (63,0% MRSA и 12,0% MSSA) содержали гена qacA / B , и гена qacA / B были более распространены, чем ген smr , который был обнаружен. в 5,8% из S. aureus (6,4% MRSA и 5,0% MSSA). Они подчеркнули, что преобладание генов устойчивости к антисептикам является широко распространенной проблемой в европейских больницах. Наше исследование показало, что присутствие гена qacA / B в клинических штаммах S.aureus было ниже (10.3%), чем smr генов, которые были более распространены (13,8%), чем европейские штаммы. Вали и др. [10] сообщили, что в Великобритании наиболее распространены гены smr (44,2%), за ними следуют qacA / B (8,3%) и qacH (3,3%), и что qacA / B и smr были обнаружены одновременно у 4,2% изолятов; однако они не обнаружили qacG в 120 клинических штаммах MRSA. В отличие от Vali et al. мы обнаружили высокую частоту qacG (7/10; 70.0%) в штаммах MRSA; но ген qacH не обнаружен. Мы также обнаружили гена qacA / B одновременно с smr в 5,2% (1/19) MSSA и 7,4% (2/27) MRCNS, с qacG в 50,0% (5/10) MRSA, и qacJ в 11,2% (3/27) MRCNS и 38,4% (5/13) MSCNS.

Longtin et al. [28] сообщили, что гена smr чаще (7,0%), чем гена qacA / B (2%), в 334 изолятах MRSA, собранных из двух канадских отделений интенсивной терапии в период с 2005 по 2009 год, и ни один штамм не содержал оба гена.Noguchi et al. [22] выявили гена qacA / B в 14,0% и гена smr в 28,0% из 71 клинического изолята MRSA в Японии. Alam et al. [29] сообщили, что в 522 клинических изолятах S. aureus из больницы в Японии, qacA / B был более распространен в MRSA (32,6%) и более распространен в MSSA (7,5%), чем гены smr , которые частота составила 3,3% в MRSA и 5,9% в MSSA.

Zhang et al. [30] сообщили, что 50,0% штаммов MRSA и 16% штаммов MSSA были положительными по гену qacA / B , и это различие было статистически значимым (p: 0.003). В нашем исследовании гены smr и qacA / B существовали с одинаковой частотой (10,0%) в штаммах MRSA, а гены smr были более распространены (15,7%), чем гены qacA / B (10,5%) в MSSA. штаммы.

Zhang et al. [30] сообщили, что ЦНС несла больше гена qacA / B, (56,7%) и гена smr (18,1%), чем S. aureus (41,2% и 11,8%, соответственно) в штаммах, выделенных из ноздрей медсестер в больнице. больница в Гонконге. В том же исследовании они обнаружили значительную разницу в частоте qacA / B между MRCNS (66.9%) и MSCNS (35,1%) ( p <0,001). Они наблюдали аналогичные результаты для smr ( p : 0,001). В нашем исследовании частота генов qacA / B и smr в MRCNS (63% и 14,8% соответственно) была очень близка к таковой для MSCNS (61,5% и 23,0% соответственно).

Ye et al. [16] исследовали частоту qacG , qacH и qacJ в 237 S. aureus (включая 12 MRSA) и 604 изолятах ЦНС (139 из которых были устойчивы к метициллину).Они обнаружили, что изолят S. aureus от медсестры (1,9%) содержал qacJ . Из qacG -положительных изолятов один содержал qacA / B , а другой smr . В том же исследовании они обнаружили, что МПК ген-положительных штаммов были в 2 раза выше, чем МПК отрицательных контролей, а присутствие второго гена qac еще больше повысило МПК. Частота устойчивости к гентамицину, фузидовой кислоте, клиндамицину и тетрациклину увеличивалась у ген-положительных изолятов, но изоляты MRSA не содержали эти гены.

Лю и др. [11] обнаружили, что 94,6% (53/56) QAC-толерантных изолятов S.aureus были положительными по гену qacA / B . Частоты smr и qacH составили 3,6% и 7,1% соответственно. QacG не был обнаружен ни в одном изоляте. Исследователи пришли к выводу, что изолятов S. aureus из Китая могут выжить при надлежащих концентрациях некоторых биоцидов при использовании.

Zhang et al. [30] обнаружили связь между наличием генов устойчивости к антисептикам и устойчивостью к некоторым анибиотикам (цефокситин, пенициллин, ципрофлоксацин, SXT, тетрациклин, клиндамицин) и пониженной чувствительностью к антисептикам (BAC: MIC ≥4 мкг / мл и CHDG: МИК ≥2–4 мкг / мл).Мы также обнаружили значительную разницу ( p <0,01) между наличием генов антисептической устойчивости и значением BAC (MIC> 4 мкг / мл), но не устойчивостью к антибиотикам ( p > 0,05) у изолятов стафилококков.

В ограниченное количество исследований генов устойчивости к антисептикам были включены клинические Enterococcus spp . изолирует. Bischoff et al. [17] обнаружили, что 1 из 42 (2,38%) изолятов E. faecalis из образцов крови содержал qacA / B ; 1 из 109 (0.92%) изолятов E. faecalis из проб стула, содержащих smr ; и № Enterococcus spp . Изоляты были положительными по генам qacG , qacH или qacJ . В отличие от Bischoff et al. [17] мы не смогли найти никаких генов qacA / B и smr в Enterococcus spp . До сих пор в энтерококках не было зарегистрировано гена qac , кроме qacC , qacEΔ1, qacZ и qacA / B .Мы также не обнаружили гены qacG , qacH или qacJ в изолятах энтерококков.

Bhardaj et al. [31] сообщили, что значения MIC для E. faecium и E. faecalis для CHDG варьировались от 0,5 до 16 мкг / мл. Они также обнаружили, что гены устойчивости к VanA-типа (VRE) индуцируются суббактерицидными уровнями CHDG. Серьезную озабоченность вызывает вопрос о том, приводит ли воздействие CHDG с уровнями ниже МИК к перекрестной устойчивости к антибиотикам при клиническом применении. МИК BAC и CHDG в нашем Enterococci spp .изоляты варьировались от 8 до 16 мкг / мл и от 6 до 12 мкг / мл соответственно. Однако была статистически значимая разница ( p <0,01) МИК в BAC и CHDG между штаммами VRE и VSE.

Наше исследование имеет некоторые ограничения. Это исследование было сосредоточено на генах антисептической устойчивости, таких как qacA / B , smr , qacG , qacH и qac J , которые в основном изолированы у грамположительных бактерий, но другие гены, такие как qacEΔ, qac F и qacZ , должны быть исследованы в будущем.Кроме того, небольшой размер выборки мог повлиять на возможную взаимосвязь между генами устойчивости к антисептикам и типом устойчивости к антибиотикам и антисептическим агентам.

Факторы свертывания крови VII, IX и X являются эффективными антибактериальными белками против устойчивых к лекарствам грамотрицательных бактерий

Клеточная линия, бактериальный штамм и конструкция плазмиды

Клеточные линии, бактериальные штаммы и плазмиды, используемые в данном исследовании, перечислены в Дополнительная информация, таблица S2.CHO-DG44 был получен от Invitrogen (№ по каталогу A1100001), а HepG2 был получен от ATCC (HB-8065). Клеточные линии не содержали микоплазм и пассировали не более чем через 1 месяц после реанимации. Все клеточные линии культивировали в соответствии с инструкциями Invitrogen или ATCC. Escherichia coli BL21 (DE3) и DH5α были получены от Invitrogen (№ по каталогу C600003 и № по каталогу 18288019 соответственно). Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa были получены из АТСС (19606, 4352 и 27853 соответственно).Все бактериальные штаммы культивировали в соответствии с инструкциями АТСС. Клинически изолированные бактерии, в том числе A. baumannii (Ab3, Ab5, Ab16, Ab18, Ab30, Ab35, Ab42, Ab46, Ab48), Enterobacter cloacae (Y1) и P. aeruginosa (L93, PA4, PA3). ), были собраны из разных отделений (отделения интенсивной терапии, гастроэнтерологии, респираторных, нейрохирургических и других отделений) Первой дочерней больницей Чэндуского медицинского колледжа, Чэнду, Сычуань, Китай, с 2012 по 2013 год. ³³ Изоляты были идентифицированы стандартными лабораторными методами и ATB New (bioMérieux, Франция), а затем были проверены с помощью ПЦР. Все бактерии выращивали на триптозном агаре, бульоне Мюллера – Хинтона или агаре (OXOID). Устойчивость этих изолятов к различным антибиотикам была определена с помощью метода разведения, описанного в руководящих принципах Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI, 2014), и измерена МИК. Результаты интерпретировали в соответствии с рекомендациями CLSI (CLSI, 2014).

клеток HepG2 использовали для клонирования FVII, , FIX и FX ; белки, исследованные в этой статье, были экспрессированы в клетках E. coli BL21 (DE3) или CHO-DG44. E. coli Клетки BL21 (DE3) культивировали при 37 ° C в среде LB; Клетки HepG2 и CHO-DG44 культивировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицин, в инкубаторе с 5% CO ₂ при 37 ° C. Для продукции белка фрагменты кДНК были созданы с использованием стандартной или перекрывающейся ПЦР со специфическими праймерами, содержащими подходящие сайты рестрикции (дополнительная информация, таблица S3).Фрагменты ПЦР и их выделенные плазмиды очищали с помощью наборов для очистки ДНК (Foregene), а затем расщепляли соответствующими ферментами. Соответствующие фрагменты были лигированы. Для клонирования FVII , FIX и FX фрагменты кДНК, соответствующие зрелым пептидам, получали из общей РНК клеток HepG2 с использованием набора для ОТ-ПЦР (Foregene). Последовательности ДНК, кодирующие mCherry, и сайт узнавания рекомбинантной протеазы вируса травления табака (rTEV) были использованы для конструирования плазмид экспрессии pET19-mCherry-rTEV-FVII-Gla, pET19-mCherry-rTEV-FVII-EGF1, pET19-mCherry-rTEV- FVII-EGF2 и pET19-mCherry-rTEV-FVII-EGF1mut, которые, как ожидалось, будут способствовать продуцированию белков с низкой молекулярной массой.Все клонированные последовательности были подтверждены секвенированием ДНК.

Мыши

Шестинедельные самцы мышей BALB / c, полученные из Академии лабораторных животных Сычуаньского института медицинских наук, содержались в стандартных условиях, свободных от патогенов, в учреждении по уходу за животными в Государственной ключевой лаборатории биотерапии Сычуаньского университета. Вес всех мышей после заражения составлял 20–22 г. В конце этого исследования мышей, которые были еще живы, умерщвляли воздействием CO ₂ с последующим смещением шейки матки.Все эксперименты на мышах были рассмотрены и одобрены Советом по этике животных и Комитетом по уходу за животными и их использованию в Школе наук о жизни Сычуаньского университета (проект № 20101), и были предприняты усилия, чтобы минимизировать страдания.

Продукция белка

E. coli BL21 (DE3) трансформировали pET19-lFVII, pET19-lFIX, pET19-lFX, pET19-mCherry-rTEV-FVII-Gla, pET19-mCherry-rTEV-FVII, pET19-mCherry-rTEV-FVII-EGF2 и pET19-mCherry-rTEV-FVII-EGF1mut, соответственно.Трансформированные бактерии выращивали в LB при 37 ° C. При OD ₆₀₀ 0,6 добавляли IPTG до конечной концентрации 1 мМ, и клетки выращивали в течение ночи при 18 ° C со встряхиванием при 180 об / мин. Полученные бактерии собирали центрифугированием, а затем разрушали ультразвуком в уравновешивающем / промывочном буфере (буфер EW, 300 мМ NaCl, 1% PMSF и 50 мМ фосфат натрия, pH 7,4). После 30 мин центрифугирования при 40 000 × g , His-меченные белки в супернатанте очищали с использованием кобальтовой смолы HisPur ™ (Thermo Fisher) в соответствии с протоколом производителя.Очищенные белки диализовали против буфера для диализа (150 мМ NaCl, 25 мМ Tris-HCl, pH 7,4), а затем концентрировали с использованием устройства Amicon Ultra 10K (Millipore).

Для стабильной эукариотической экспрессии His-tagged hFVII, FVII, FIX и FX, клетки CHO-DG44 трансфицировали плазмидой pcDNA3.1-His-hFVII, pcDNA3.1-His-FVII, pcDNA3.1-His- FIX и pcDNA3.1-His-FX, соответственно, с использованием реагента TransEasy (Foregene). Через два дня после трансфекции трансфицированные клетки отбирали с помощью 800 мкг / мл Генетицина (G418, GIBCO) в течение 10 дней, а затем поддерживали с помощью 400 мкг / мл G418.Клеточные клоны выделяли, и уровни экспрессии белков, меченных His, анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Образованные клетки CHO-DG44-hFVII, CHO-DG44-FVII, CHO-DG44-FIX и CHO-DG44-FX культивировали в DMEM с добавлением 10% FBS и 400 мкг / мл G418. Как только культура достигла 80% слияния, среду заменяли бессывороточной средой CHO (EX-CELL CD CHO, SAFC Biosciences). Через три дня культуральную среду собирали центрифугированием в течение 5 минут при 1000 × g , и меченные His белки в супернатанте очищали, диализовали и концентрировали, как описано выше.

FVII был активирован двухэтапным методом. ¹⁵ Вкратце, 300 нМ FVII инкубировали в течение 1,5 ч при температуре окружающей среды с 3 нМ rFVIIa (Novo Nordisk) в буферном растворе (0,25 мМ CaCl ₂ , 100 мМ NaCl, 1 мкг / мл поли-D-лизина, 10 мМ Трис-HCl, pH 7,4). Реакцию активации останавливали добавлением 5 мМ CaCl ₂ .

Для получения трех доменов lFVII (т.е. Gla, EGF1 и EGF2) и мутантов EGF1 очищенные гибридные белки His-mCherry-rTEV-FVII-Gla, His-mCherry-rTEV-FVII-EGF1, His-mCherry -rTEV-FVII-EGF2 и His-mCherry-rTEV-FVII-EGF1mut обрабатывали AcTEV (Invitrogen) для расщепления их меток His-mCherry.Очищенные слитые белки собирали на Ni-NTA агарозе (QIAGEN) после 1-часовой инкубации при 4 ° C. Агарозу центрифугировали при 700 × g в течение 3 минут при 4 ° C, а затем суспендировали в 450 мкл буфера TBS перед обработкой 100 ед. AcTEV, и полученную смесь инкубировали при 4 ° C в течение ночи. Супернатант, содержащий Gla, EGF1, EGF2 или EGF1mut, собирали 5-минутным центрифугированием при 700 × g и 4 ° C, образцы белка концентрировали и очищали гель-фильтрационной хроматографией с использованием Superdex 75 5/150. Колонка GL (GE Healthcare) на системе ÄKTA Explorer FPLC (Amersham Pharmacia) с рабочим буфером (50 мМ Na ₂ HPO ₄ / NaH ₂ PO ₄ , 5 мМ β-меркаптоэтанол и 300 мМ NaCl, pH 7.4). Белковые фракции собирали и концентрировали с помощью устройства Amicon Ultra 3K (Millipore).

Вестерн-блоттинг

Образцы белка фракционировали с помощью SDS-PAGE и переносили электронным способом на PVDF-мембраны при 100 В в течение 1 часа при 4 ° C. Затем мембраны промывали буфером PBST (0,2% Твин-20 в фосфатно-солевом буфере (PBS)), блокировали в течение 2 часов PBST, содержащим 5% обезжиренного сухого молока, и инкубировали со специфическим первичным антителом в течение 1 часа при температура окружающей среды.Затем мембраны промывали PBST перед инкубацией с IgG, конъюгированным с пероксидазой хрена, в течение 1 часа. Полученные блоты визуализировали с помощью набора ShinEasy Subpico ECL (Foregene) и экспонировали на рентгеновской пленке.

Анализ кинетики роста

E. coli DH5α выращивали в LB при 37 ° C до тех пор, пока OD ₆₀₀ не достигала 0,6, и разбавляли в 10 раз. Затем аликвоты по сто микролитров добавляли в каждую лунку микротитровальных планшетов, содержащих предварительно нагретые LB, дополненные ЖК, антибактериальными агентами или без лекарств (без обработки).Планшеты накрывали и инкубировали при 37 ° C со встряхиванием со скоростью 180 об / мин в течение различных периодов инкубации. Измерения OD ₆₀₀ были выполнены на универсальном микропланшетном спектрофотометре (BioTek). Кроме того, специфические антитела были добавлены вместе с FVII, FIX или FX для проверки влияния на антибактериальную активность FVII, FIX и FX.

Анализ кинетики киллинга

E. coli DH5α выращивали в LB в течение ночи и разбавляли в свежей среде до OD ₆₀₀ 0.1. После добавления ЖК в концентрациях 4 × MIC (100 мкг / мл) бактерии культивировали при 37 ° C со встряхиванием при 180 об / мин, а затем собирали через определенные интервалы. Собранные бактерии разбавляли PBS, и 100 мкл образцов разведений наносили на чашки с агаром LB. Планшеты инкубировали при 37 ° C в течение 16 ч и подсчитывали полученные КОЕ.

Анализ потери функции

Нейтрализацию эндогенных FVII, FIX или FX проводили путем внутривенной инъекции специфических антител.Коммерческие продукты антител, включая антитело против mFVII (R&D Systems), антитело против mFIX (K-20, Santa Cruz Biotechnology), антитело против mFX (C-20, Santa Cruz Biotechnology), нормальный кроличий IgG (Santa Cruz Biotechnology) и нормальный козий IgG (Santa Cruz Biotechnology) разбавляли физиологическим раствором для приготовления следующих растворов антител: раствор 1, содержащий 10 мкг / мл антитела против mFVII; раствор 2, содержащий 80 мкг / мл антитела против mFIX; раствор 3, содержащий 80 мкг / мл антитела против mFX; раствор 4, содержащий все антитела, специфичные к mFVII, mFIX и mFX, с концентрациями, описанными выше; раствор 5, содержащий 160 мкг / мл нормального кроличьего IgG; раствор 6, содержащий 160 мкг / мл нормального козьего IgG.Растворы 1–4 использовали для нейтрализации эндогенных FVII, FIX и FX, а растворы 5 и 6 использовали в качестве контрольных антител. Самцам мышей BALB / c (возраст 6 недель, вес 20–22 г) вводили через хвостовую вену 0,1 мл приготовленных растворов антител (для каждой инъекции раствора n = 8). Через 1 час после инъекции антител мышам через хвостовую вену вводили 1 × 10 ⁶ КОЕ / мл бактерий в 0,2 мл физиологического раствора. Подсчитывали количество выживших животных в различные моменты времени.Анализ Каплана-Мейера использовался для определения значимости различий между экспериментальной и контрольной группами. Кроме того, через 3 часа после инъекции антитела из ретроорбитального синуса собирали кровь и добавляли цитрат натрия до конечной концентрации 10,9 мМ. Образцы крови центрифугировали при 3000 об / мин в течение 15 минут, и отделенные образцы плазмы использовали для определения АЧТВ и РТ с помощью анализатора гемагглютинации (KING DIAGNOSTIC).

Бактериальную нагрузку в крови, перитонеальной жидкости, печени и селезенке

Бактериальную нагрузку в крови, перитонеальной жидкости, печени или селезенке мышей измеряли, как описано. ^17,32 Через 2 часа бактериальной инокуляции кровь собирали из ретроорбитального синуса и сразу же смешивали с гепарином, перитонеальную жидкость извлекали из брюшины, а печень и ткани селезенки собирали у убитых мышей, взвешивали и гомогенизировали в физиологическом растворе. Серийные разведения крови, перитонеальной жидкости и гомогенатов тканей высевали на чашки с селективным агаром и инкубировали в течение ночи при 37 ° C. Цетримидный селективный агар (OXOID) использовали для культивирования P.aeruginosa , а селективный агар для ацинетобактеров (CHROMagar) использовали для роста A. baumannii . КОЕ рассчитывали как КОЕ / мл для крови или перитонеальной жидкости и как КОЕ / г сырого веса для тканей печени. Поскольку вес селезенки у мышей <1 г, КОЕ для селезенки рассчитывали как КОЕ на свежий орган.

Антибактериальная активность LC против голодных

После ночного роста в LB при 37 ° C клетки E. coli DH5α были промыты и разведены в гипертоническом TBS (буфер TBS, содержащий 15% (мас. / Мас.) v) сахароза) до OD ₆₀₀ 0.1. После добавления различных антибактериальных агентов бактерии инкубировали при 37 ° C в течение 4 ч при встряхивании со скоростью 180 об / мин, а затем разбавляли гипертоническим TBS. Разведения высевали на чашки с гипертоническим агаром LB и инкубировали при 37 ° C в течение 16 часов. Подсчитывали окончательное количество КОЕ. Тот же эксперимент повторяли с гипотоническим TBS (буфер TBS, содержащий 0,1% (мас. / Об.) NaCl) и чашками с гипотоническим LB-агаром.

Обнаружение SEM

E. coli DH5α выращивали в LB до OD ₆₀₀ , равного 0.2. После добавления ЖК, лизоцима, полимиксина B или отсутствия лекарственного средства (необработанного) бактерии инкубировали при 37 ° C со встряхиванием при 180 об / мин и собирали в разные моменты времени (1,5, 2,5 и 4 ч). Инкубацию также проводили для очищенных PGN E. coli K12, S. aureus и B. subtilis (Invivogen) в буфере PBS в течение 3 часов. Собранные бактерии или PGN были промыты перед ресуспендированием в буфере PBS для обнаружения с помощью SEM.

Обработанные образцы бактерий и PGN были помещены на предметные стекла, и предметные стекла были помещены на горячую плиту при 37 ° C для сушки.Затем предметные стекла замачивали в 2% глутаральдегиде в PBS на 2 часа перед тщательной промывкой буфером PBS. Образцы, зафиксированные на предметных стеклах, были обезвожены с помощью серии восходящего спирта (30%, 50%, 70%, 80%, 90 и 100% EtOH) в течение 15 минут каждый с последующим 15-минутным замачиванием в 100% EtOH. После сушки до критической точки образцы визуализировали с помощью SEM. ⁴³

Взаимодействие LC с LPS

Взаимодействия были проверены с помощью 3 основных процедур: (1) подготовка DPX; (2) эксперименты по связыванию DPX; и (3) эксперименты по ингибированию связывания.

Приготовление DPX проводили, как описано ⁴⁴ и подробно описано ниже. Раствор 10 мг дансилхлорида (Sigma-Aldrich) в ацетоне (0,8 мл) инкубировали с 40 мг полимиксина B-сульфата (Sigma-Aldrich) в 0,1 М растворе NaHCO ₃ (1,2 мл) без перемешивания. и в отсутствие света в течение 90 мин при температуре окружающей среды. Супернатант наносили на колонку PD-10 (Sephadex G25M, GE Healthcare) и элюировали 0,145 М NaCl в 0,01 М буфере PBS (pH 7.4). Был собран пик, показывающий оранжевую флуоресценцию в ультрафиолетовом свете, и было обнаружено, что он содержит DPX. Производное DPX экстрагировали из объединенных фракций н-бутанолом. Последующее удаление растворителя с помощью вакуумной сублимационной сушки давало очищенный DPX в виде бледно-желтого порошка. Количество DPX определяли динитрофенилированием.

После получения DPX были проведены эксперименты по связыванию DPX для определения оптимальной концентрации DPX. Флуоресценцию LPS-связывающего DPX измеряли с использованием многомодового считывающего устройства со спектральным сканированием (Thermo Fisher) при длине волны возбуждения 325 нм и длине волны испускания 554 нм.Анализы связывания выполняли путем измерения флуоресценции в лунках после добавления порций DPX в лунки микротитрационного планшета, содержащего 0,3 мкг LPS в 100 мкл 5 мМ буфера HEPES (pH 7,4). В этом исследовании оптимальная концентрация DPX была определена как 3 мкМ.

В экспериментах по ингибированию связывания LC и полимиксин B, которые использовали в качестве дополнительных ингибиторов связывания DPX с LPS, титровали в лунки микротитровального планшета, содержащие 0.3 мкг LPS в 100 мкл 5 мМ буфера HEPES (pH 7,4). После 30 мин инкубации при 37 ° C добавляли DPX до конечной концентрации 3 мкМ. Регистрировали снижение флуоресценции (процент ингибирования). BSA использовали в качестве отрицательного контроля для LC.

Подготовка образцов для анализа MS

Шестьдесят микрограммов lFVII были смешаны с 250 мкг E. coli K12 LPS (Invivogen) или 280 мкг липида A E. coli F583 (Sigma-Aldrich) в 400 мкл физиологический раствор, и полученную смесь инкубировали в течение ночи при 37 ° C при встряхивании при 160 об / мин.Затем собирали супернатант реакционной смеси после 10 мин центрифугирования при 17000 × g перед диализом против дистиллированной воды. Очищенный lFVII и необработанный lFVII E. coli, K12 LPS или липид A E. coli F583 получали в качестве контролей.

MALDI / TOF-MS

Один микролитр 10 мг / мл раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (DHB) в 33% этаноле наносили на измельченную стальную мишень TF MTP 384 (Bruker Daltonics). Образец объемом 1 мкл, приготовленный выше, затем смешивали с каплей DHB и сушили в потоке воздуха.Образцы анализировали на приборе Autoflex TOF / TOFII (Bruker) с азотным лазерным лучом 377 нм. Прибор работал в режиме положительного сбора данных и управлялся с помощью программного пакета FlexControl 2.2. Все спектры были получены с использованием режима отражателя с ускоряющим напряжением 19 кВ, напряжением отражателя 20 кВ и импульсным извлечением ионов 140 нс в режиме положительных ионов в диапазоне сбора ( m / z ) 600 –7000. Данные были собраны в среднем по 500 лазерным выстрелам с использованием самой низкой энергии лазера, необходимой для получения достаточного отношения сигнал / шум.Списки пиков были созданы из спектров МС с использованием программного обеспечения Bruker Flex Analysis (версия 3.0). Спектры распада после источника с помощью системы Bruker Daltonics LIFT регистрировали при ускорении ионов-предшественников и напряжении ускорения фрагментов 18,96 кВ (напряжение LIFT 4,37 кВ). Напряжения отражателя 1 и 2 были установлены равными 23,49 и 9,69 кВ соответственно. Образцы также анализировали безматричным MALDI-TOF-MS в диапазоне сбора данных ( m / z ) 100–2000 в режиме положительных или отрицательных ионов. ⁴⁵

ESI-MS

Анализы ESI-MS проводили на масс-спектрометре Micromass Q-TOF premier (Waters) в режиме положительных или отрицательных ионов. Образцы вводили через головку капилляра при 5 кВ в ионный источник с использованием линейного шприцевого насоса со скоростью 10 мкл / мин, и спектры сканировали в диапазоне сбора данных ( m / z ) от 100 до 2000. В качестве завесного газа использовался азот. ⁴⁶

Кинетический анализ активности lFVII в отношении

Анализы с использованием E. coli K12 LPS в качестве субстрата были выполнены в трех повторностях, и E. coli K12 LPS, содержащийся в реакционных смесях, был окрашен с использованием лизата амебоцитов хромогенной конечной точки Tachypleus (CETAL, Xiamen Bioendo Technology, Co., Ltd, Китай) и измеряли с помощью универсального микропланшетного спектрофотометра (BioTek) при 545 нм. Диапазон концентраций субстрата, использованный для определения значений Km и Vmax , составлял 0.04–2,6 мМ. Для анализа ЛПС E. coli K12, приготовленный в 10 мкл физиологического раствора с удвоенной конечной концентрацией, добавляли к 10 мкл физиологического раствора, содержащего 1 мкг lFVII, и затем реакции проводили при 37 ° C в течение 1 часа. В начале и в конце процесса реакции из реакционных смесей отбирали аликвоты по 5 мкл. После 10 мин тепловой инактивации при 70 ° C собранные образцы были разбавлены соответствующим образом для достижения линейного диапазона CETAL. Последующее проявление цвета и измерение оптической плотности проводили в соответствии с протоколом производителя.Статистический анализ соответствия линейной линии тренда полученного графика Лайнуивера – Берка дал значение r ² , равное 0,994.

E. coli K12 LPS также использовали для определения профилей активности lFVII при температуре и pH. Все реакционные смеси содержали 1 мкг lFVII и 0,86 мМ E. coli K12 LPS, и все реакции проводили в объемах 20 мкл. Для измерения оптимального pH используется серия стандартных физиологических растворов pH в диапазоне pH 6.2–8,6 использовали в качестве буфера для ферментативной реакции. Для измерения оптимальной температуры были проведены подробные исследования в диапазоне температур 27–47 ° C. Поглощение при 545 нм измеряли с использованием тех же методов, описанных выше, для определения относительной активности в тестируемых диапазонах температуры и pH.

Анализ разложения ЛПС электрофорезом

E. coli K12 LPS (Invivogen), E. coli 055: B5 LPS (Sigma-Aldrich) или A. baumannii Ab3 LPS и P.aeruginosa PA4 ЛПС, очищенный методом горячей водно-фенольной экстракции. ⁴⁷ смешивали с lFVII, lFIX, lFX, EGF1 или мутантами EGF1 в физиологическом растворе, и полученные смеси инкубировали при 37 ° C со встряхиванием при 160 об / мин. После инкубации супернатант реакционных смесей собирали центрифугированием при 17000 × g , а затем подвергали анализу Tricine-SDS-PAGE, как описано. ⁴⁸

Эксперименты по возмущению химического сдвига ЯМР

Стандартный спектр ¹ H– ¹³ C HSQC был зарегистрирован с использованием естественного обилия образца EGF1 (~ 3 мг / мл) на спектрометре ЯМР Bruker 500 МГц (AVANCE). III) при 298 К.Затем были получены два спектра HSQC путем добавления к образцу LPS с их молярным соотношением (EGF1: LPS) 1: 0,1 и 1: 0,25. Данные ЯМР обрабатывали с помощью NMRPipe и анализировали с помощью Sparky.

Измерение MBC

Серии разведений каждого антибактериального агента проводили путем разбавления исходного раствора тестируемого агента в среде до желаемого диапазона концентраций и конечного объема 100 мкл в каждой лунке микротитровального планшета. Бактериальные клетки, которые дали OD ₆₀₀ , равную 0,6, разводили до 5 × 10 ⁶ клеток / мл в среде, и в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора бактерий.Затем микротитровальный планшет инкубировали при 37 ° C в течение 3 ч при встряхивании со скоростью 180 об / мин. Для каждой лунки микробный раствор разбавляли физиологическим раствором с использованием соответствующего коэффициента разбавления и помещали на чашку с агаром. Планшеты инкубировали при 37 ° C в течение 16 ч, а затем подсчитывали полученные КОЕ и выражали их как КОЕ / мл. Также измеряли контроль, состоящий из клеток без какой-либо обработки. Кривые «концентрация-гибель» строили для КОЕ / мл как функции концентрации агента, и использовали линейный регрессионный анализ для определения значений МБК, при которых КОЕ / мл становилось равным нулю.Для всех тестируемых бактерий для измерения МБК использовали питательную среду (MHB, OXOID) и TBS, соответственно.

Выделение LPS-дефицитных

LPS-дефицитный A. baumannii был выделен, как описано. ⁴⁹ Вкратце, OD ₆₀₀ 1,0 из A. baumannii Ab3 высевали на агар LB, содержащий 10 мкг / мл колистина (Sigma-Aldrich). Выделенные колонии собирали и реплики высевали на агар LB, содержащий ванкомицин (Sigma-Aldrich, 10 мкг / мл), и агар LB, содержащий колистин (10 мкг / мл).Колонии, чувствительные к ванкомицину, но устойчивые к колистину, считались LPS-дефицитными.

Статистический анализ

-тест Стьюдента t проводили для сравнения различий между обработанными группами и их парными контролями. Данные о бактериальной нагрузке анализировали с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) и критерия Стьюдента t . Все результаты были представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение, и значения P <0,05 считались значимыми.

Обнаружение коронавируса COVID-19 (SARS-CoV-2), характеристика, производство вакцин и терапии

Состав

Наш обширный портфель технологических химикатов, вспомогательных веществ и липидов разработан для требовательных, срочных приложений, включая создание вакцин.

Мы предлагаем инновационные вспомогательные вещества для доставки лекарств на липидной основе, такие как сквален и синтетический холестерин, с превосходными характеристиками, позволяющими упростить и оптимизировать процессы создания рецептур.Вы также можете воспользоваться преимуществами нашего производства липидов по индивидуальному заказу, чтобы разработать индивидуальный подход к вашему API.

Чтобы удовлетворить беспрецедентный спрос, вызванный глобальной разработкой вакцин против COVID-19, мы увеличили производственные мощности и можем поставлять материалы GMP в количествах от граммов до тонн.

Многие технологические химические вещества в нашем широком ассортименте являются частью нашей программы Emprove ^® , которая предоставляет исчерпывающую нормативную документацию для упрощения и ускорения подачи нормативных документов.

Услуги по тестированию биобезопасности

Мы здесь, чтобы сотрудничать с вами. Наши испытательные центры работают, и мы активно привлекаем биофармацевтическое сообщество к тому, чтобы сделать тестирование биобезопасности приоритетным во время этого кризиса в области здравоохранения. Как и во время вспышек вируса Зика, атипичной пневмонии и лихорадки Эбола, мы здесь для того, чтобы поддержать разработчиков и производителей вакцин и терапевтических средств в расстановке приоритетов в лечении. Свяжитесь с нашими коммерческими командами, чтобы обсудить ваши потребности.

Узнайте больше о наших исследованиях по очищению от вирусов BioReliance ^® .

Узнайте больше о наших испытаниях высвобождения партии массового урожая BioReliance ^® и комплексном испытании высвобождения партии BioReliance ^® .

Узнайте больше о наших услугах по характеризации продуктов BioReliance ^® .

Узнайте больше о наших услугах по банкингу клеток и биорепозиторию BioReliance ^® .

BioReliance ^® Тестирование массового сбора вакцины

Тестирование биобезопасности массового сбора вакцины и контрольных клеток включает ряд тестов для демонстрации отсутствия побочных агентов (массовый сбор и контрольные клетки) и подтверждения идентичности вакцинного материала (массовый сбор).Выбор тестов должен основываться на оценке риска вирусной безопасности, а также на соответствующих нормативных актах и ​​руководящих документах и, как правило, касается следующих ключевых областей:

• Обнаружение и идентификация интересующего гена вакцины
  
• Титр вакцинного вируса
  
• Стерильность, микоплазмы и микобактерии
  
• Нейтрализация вакцинного вируса для клеток и in vivo тестов на случайные вирусы
  
• Дополнительные вирусы

Тесты могут быть выполнены с использованием ряда методов, от традиционных анализов культивирования и секвенирования до современных быстрых методов, использующих новые молекулярные методы, такие как секвенирование следующего поколения и вырожденная ПЦР.Свяжитесь с [email protected], чтобы обсудить ваши потребности.

Характеристика клеточной линии

Узнайте больше о наших услугах по характеризации клеточных линий BioReliance ^® .

Узнайте больше о наших услугах по характеризации продуктов BioReliance ^® .

Узнайте больше о наших исследованиях по очищению от вирусов BioReliance ^® .

Узнайте больше о наших испытаниях высвобождения партии массового урожая BioReliance ^® и комплексном испытании высвобождения партии BioReliance ^® .

Узнайте больше о нашем BioReliance ^® секвенирования нового поколения (NGS).

Узнайте больше о нашей платформе быстрого молекулярного обнаружения BioReliance ^® Blazar.

Исследования эффективности вакцины BioReliance ^®

Исследования эффективности вакцины проводят, чтобы установить способность вакцины вызывать защитный ответ. Они должны быть выполнены до первых клинических исследований на людях. Эти исследования обычно требуют иммунизации в подходящую модельную систему и демонстрации иммунного ответа с использованием сначала методов ELISA, а затем демонстрации защитного иммунного ответа с использованием методов вирусной нейтрализации.Затем эти методы можно модифицировать и использовать в качестве анализов высвобождения активности для высвобождения каждой партии клинического продукта, а также в качестве метода определения стабильности для исследований стабильности. Свяжитесь с [email protected], чтобы обсудить ваши потребности.

Контроль качества и мониторинг окружающей среды

Эффективная гарантия качества, постоянный контроль качества и точные результаты являются ключом к производству безопасных терапевтических средств. Наши комплексные решения для обнаружения микробов и обеспечения стерильности помогут вам соответствовать самым высоким стандартам качества и нормативным требованиям.

Многие организации испытывают повышенный производственный спрос в результате пандемии COVID-19.